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质粒DNA提取、纯化和鉴定

发布时间:2020-12-03   点击次数:351次

一、实验原理

     细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯fang抽提除去,后获得纯度较高的质粒DNA。

    简言之:在细胞破碎后,染色体DNA和质粒DNA 释放到溶液中,当PH为12时,DNA的氢键断开,由于质粒DNA为环状结构,所以两条链没有分离,而染色体DNA两条链完全分开,氢键断开而分离。当PH值恢复到中性时,质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中-------------除去染色体DNA、大分子RNA和蛋白质-SDS复合物缠连成白色絮状沉淀,离心分离。

加入乙醇后,上清质粒DNA凝聚成沉淀,会有RNA存在,加入RNA酶,使RNA降解。---------------去除RNA分子。

二、实验仪器

     微量取液器(20、200、1000微升)、台式高速离心机、恒温震荡摇床、高速蒸汽消毒器(灭菌锅)、涡旋震荡器、电泳仪、琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

三、实验步骤

    碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。

①细菌的培养和收集

将含有质粒pBS的DH5α菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。 (培养箱、摇床)

②质粒DNA少量快速提取   

1、取1.5ml培养液倒入1.5ml eppendorf管中,4℃下12000g离心30秒。(移液器、离心机)   

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。     

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。(移液器)     

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口,快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。(移液器)    

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,并倒置离心管,温和振荡10秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心5-10分钟。 (移液器、离心机)     

6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯fang(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。 

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟,然后4℃下12000g离心10分钟。 (冰箱、离心机)    

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。     

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。     

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RNaseA)中,储于-20℃冰箱中。

溶液一:重悬菌体,提供缓冲环境。

  溶液二:氢氧化钠和SDS裂解菌体细胞壁、在细胞膜上穿孔,释放细胞内的质粒。

  溶液三:中和氢氧化钠、SDS中的钠被钾替换,吸附菌体产生沉淀。

 ③DNA鉴定

实验仪器

   恒温振荡培养箱,高速冷冻离心机,旋涡振荡器,水浴锅,1.5mL离心管,50mL离心管,不同型号的吸头,微量移液器,微波炉,电泳仪,制胶槽,电泳槽,梳子,锥形瓶,电子天平,手套,紫外灯,Eppendorf管等。 

DNA纯度检测

(1) 取40mLTAE(1×)于300mL锥形瓶中,加入0.4g琼脂糖,放入微 波炉内使其熔化,60℃时倒入准备好的制胶槽中。(微波炉、制胶槽、梳子)  

(2) 取5.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液,混合,进行点样。(移液器、电泳仪) 

(3) 点样完毕后,100V,200mA条件下电泳30min。  

(4) 电泳完毕后,进行EB染色,用凝胶成像仪拍照,得到实验结果。(凝胶成像系统)

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