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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

发布时间:2020-12-03   点击次数:65次

名词解释及原理

1、感受态细胞:应用一些特殊方法(如点击法,CaCl2处理)处理后,使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变,处于能允许外源DNA分子进入的状态,即为感受态细胞。

2、转化(Transformation):是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段。

CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温,低渗(0℃0.1mol/LCaCl2)的溶液中,菌体细胞膨胀成球形,局部失去细胞壁或细胞壁溶解,外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面,经42℃短暂热冲击处理,促使DNA复合物进入细胞,从而实现外源基因的转化。

实验器材  ①超净工作台;②恒温摇床;③离心机;④V-1100分光光度计;⑤水浴锅;⑥微量移液器。

实验步骤 

1.感受态细胞的制备和保存

制备

(1)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。    

(2) 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。    

(3)弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

保存

感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

转化

(1)从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。   

(2)加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。   

(3)42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。   

(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。     

(5)将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

实验过程图解

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