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完整的PCR扩增实验过程及实验器材

发布时间:2020-10-22   点击次数:107次

 PCR实验室仪器:

【实验目的】
通过本实验学习 PCR 反应的基本原理,掌握 PCR 的基本操作技术。
【实验原理】
PCR 用于扩增位于两端已知序列之间的 DNA区段,即通过引物延伸而进行的重复双向
DNA合成。
基本原理及过程如下:
PCR 循环过程中有三种不同的事件发生:(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定 DNA
聚合酶进行 DNA合成。
1. 变性:加热使模板 DNA在高温下(94-95℃)变性,双链间的氢键断裂而形成两条单
链,即变性阶段。
2. 退火:在体系温度降至 37-65℃,模板 DNA与引物按碱基配对原则互补结合,使引物
与模板链 3’端结合,形成部分双链 DNA,即退火阶段。
3. 延伸:体系反应温度升至中温 72℃,耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板,在引物
的引导下,利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸(dNTP),按 5’到 3’方向复制出互补 DNA,即引物的延伸阶段。
上述 3 步为一个循环,即高温变性、低温退火、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲,每经过
一个循环,样本中的DNA量应该增加一倍,新形成的链又可成为新一轮循环的模板,经过 25~30 个循环后DNA可扩增 106~109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成:DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成
的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
【仪器、材料、试剂】
(一) 仪器材料
1.PCR 热循环仪
2.电泳凝胶成像系统
3.高速离心机
4.Tip 头、离心管
(二) 试剂
1.DNA模板(自己提取 DNA)
2.4种 dNTP
3. 引物 1、引物 2
4. Taq 酶
5. 琼脂糖
6. DNA相对分子量标准物
7. 三蒸水
【实验步骤】
(一)PCR反应混合液的配制:反应体系 25 μL, 在无菌的0.2 mL 离心管中按下列操作程序加样:
1.按下列次序加入下列各组成分:【这一步用的仪器及材料有移液器(含吸头)、EP管】
反应物 体积/μL
ddH2O 17.3
10 x Buffer 2.5                 
25 mmol/L MgCl2 2.0 
10 mmol/L dNTP 0.5 
10 μM 上游引物 1 0.4 μmol/L
10 μM 下游引物 1 0.4 μmol/L
DNA Taq 聚合酶 0.2   2. 用手指轻弹管底,使溶液混匀
3. 高速离心机瞬时离心,使溶液集中于管底【离心机】
(二) PCR 循环程序【PCR仪】
按下述程序进行扩增:
 94℃ 预变性 3min
 94℃ 变性 30s
 50℃ 退火 40s   40cycle
 72℃ 延伸 1min
72℃ 充分延伸 5min
(三)PCR扩增结果的检测
1.配制 1.0% 琼脂糖凝胶 【高压蒸汽灭菌器、电子天平、制胶板、插样梳、锥形瓶、微波炉或电炉】                                                   
2.4μl PCR产物上样 【移液器】                           
3.5-8V/cm的电压电泳【电泳槽、电泳仪】
4.电泳结束后,EB 染色20min 【移液器】
5.凝胶成像系统观察拍照分析结果【凝胶成像系统】
【注意事项】
1. 隔离操作区,分装试剂,简化操作程序,使用一次性吸头。
2. 加样完成后要瞬时离心,保证样品沉于管底。
3. 加样顺序合理化,避免交叉污染。
 

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